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QM

QM/MM Study of Enzymatic Reactions: Analysis of Chu et al. (2014) Paper
基本信息 Wen-Ting Chu, Qing-Chuan Zheng* and Hong-Xing Zhang 作者来自吉林大学理论化学研究所发表于 Phys.Chem.Chem.Phys., 2014, 16, 3946 DOI：https://doi.org/10.1039/C3CP53935K 论文摘要双磷酸甘油酸变位酶（bisphosphoglycerate mutase, BPGM）是一种多功能酶，其主要功能是合成血红蛋白的变构效应物——2,3-双磷酸甘油酸（2,3-BPG）。该酶亦可催化2,3-BPG水解生成3-磷酸甘油酸（3-PGA）。本研究通过量子力学/分子力学（QM/MM）方法，结合元动力学（metadynamics）和伞形采样（umbrella sampling）模拟，从理论角度揭示了人类双磷酸甘油酸变位酶（hBPGM）磷酸酶与合酶活性的反应机制。模拟结果不仅呈现了两类反应路径的自由能曲线，还阐明了活性位点中关键残基（如His11和Glu89）的作用。此外，反应能量势垒计算表明，hBPGM的合酶活性显著高于磷酸酶活性，且理论估算的势垒值与实验数据高度吻合。本研究为深入解析双磷酸甘油酸变位酶家族的催化机制提供了重要理论依据。关键词：双磷酸甘油酸变位酶；QM/MM模拟；自由能曲线；能量势垒；变构效应物 Introduction hBPGM是一种红细胞特异性多功能酶，具有合酶（EC 5.4.2.4）、变位酶（EC 5.4.2.1）和磷酸酶（EC 3.1.3.13）三种活性，其核心功能是催化1,3-双磷酸甘油酸（1,3-BPG）转化为2,3-双磷酸甘油酸（2,3-BPG）。作为血红蛋白的关键变构效应物，2,3-BPG通过稳定脱氧血红蛋白构象调控氧运输效率。尽管三种活性共享同一活性位点，实验表明合酶活性显著高于其他两种，而磷酸酶活性则负责水解2,3-BPG生成3-磷酸甘油酸（3-PGA）。Wang等人通过晶体结构研究（PDB: 2H4Z）揭示了活性位点残基His11与Glu89的催化作用，并提出磷酸酶反应遵循S2机制：His11作为亲核攻击位点夺取底物的磷酸基团，Glu89则通过质子转移稳定中间态。然而，hBPGM催化过程中原子尺度动态路径（如过渡态构型、自由能变化）仍缺乏理论解析。为此，本研究首次采用量子力学/分子力学（QM/MM）方法，结合元动力学（metadynamics）和伞形采样（umbrella sampling）模拟，系统性分析磷酸酶与合酶活性的反应路径与能量势垒，旨在从理论层面揭示hBPGM催化特异性的分子基础，为酶家族功能演化与药物设计提供新见解。 Fig. 1 The proposed mechanisms for the phosphatase and the synthase reactions. Methods 体系初始模型构建研究基于人源双磷酸甘油酸变位酶（hBPGM）与底物2,3-BPG的复合物晶体结构（PDB: 2H4Z，分辨率1.50 Å），选取单体链A（Ser2-Gln256）作为分子动力学（MD）模拟的初始结构。所有结晶水分子被保留，活性位点残基的质子化状态通过PROPKA在线工具（http://propka.ki.ku.dk/）确定：Glu89保持质子化，His11在δ位点单质子化，以匹配催化机制的需求。缺失的氢原子通过AMBER 12软件的LEaP模块添加，蛋白质参数采用ff99SB力场，底物2,3-BPG的参数由通用Amber力场（GAFF）生成。体系电荷通过添加钠离子中和，并置于TIP3P水分子填充的八面体周期箱中，确保蛋白质外层与水箱壁的最小距离为8.0 Å。分子动力学模拟 hBPGM/2,3-BPG复合物的经典MD模拟分为能量优化、平衡与生产三阶段：能量最小化：分两步进行，首先对水分子和离子进行2000步最速下降法+3000步共轭梯度法优化，随后对全体系重复相同流程以消除空间冲突。升温与平衡：在NVT系综下以1 K/ps速率升温至300 K，随后进行200 ps平衡模拟，期间对蛋白质Cα原子和配体原子施加弱限制（力常数0.5 kcal/mol/Å²）。 production模拟：在NPT系综下进行20 ns自由MD模拟，采用SHAKE算法约束氢键，粒子网格Ewald（PME）方法处理长程静电相互作用（截断值10 Å），时间步长2 fs。体系稳定性通过蛋白质骨架均方根偏差（RMSD≈1.3 Å）和配体构象（RMSD≈1.0 Å）验证，所有结构可视化由PyMOL完成。 QM/MM元动力学模拟基于平衡后的MD构象，采用AMBER软件结合PLUMED 1.3插件进行量子力学/分子力学（QM/MM）元动力学模拟。 QM区域包含底物2,3-BPG、His11和Glu89，MM区域为体系其余部分，QM/MM边界通过引入四个氢连接原子处理。每部分模拟运行1 ns，采用PM3半经验方法，高斯势宽度0.35 Å、权重0.1 kcal/mol，并设置±3.0 Å能量墙防止基团逃逸。自由能面（FES）通过累积的高斯势构建，过渡态（TS）通过能量最高点确定。在QM/MM元动力学模拟中，磷酸酶和合酶活性的反应路径通过原子间距离差作为集体变量（Collective Variables, CVs）进行描述，具体定义如下：磷酸酶活性第一步（磷酸基团转移至His11）反应坐标（ξ₁）：定义为底物磷酸基团的O3-P10键长与P10-His11的NE2原子键长之差，即： R(O3−P10)−R(P10−NE2) 物理意义：正值增大时，O3-P10键断裂（距离增大），P10-NE2键形成（距离缩短），反映磷酸基团从底物转移至His11的进程。第二步（Glu89质子转移）反应坐标（ξ₂）：定义为Glu89的OE2-HE2键长与HE2-O3（底物）键长之差，即： R(OE2−HE2)−R(HE2−O3) 物理意义：负值增大时，Glu89的HE2质子向底物O3转移，促进磷酸基团脱离（图1）。合酶活性第一步反应反应坐标（ξ₃）：定义为His11的P10-NE2键长与底物1,3-BPG的P10-O6键长之差，即： R(P10−NE2)−R(P10−O6) 物理意义：正值减小时，P10-O6键断裂（距离增大），P10-NE2键形成（距离缩短），反映磷酸基团从His11转移至底物的逆过程（与磷酸酶第一步相反）。后两步实际上就是磷酸酶催化的逆反应，不用再模拟一遍了。伞形采样验证为验证元动力学结果，对同一体系进行伞形采样分析。磷酸酶反应的两步及合酶反应的第一步被划分为多个窗口（步长0.1 Å，范围-3.0~3.0 Å），每个窗口进行50 ps采样（力常数200 kcal/mol/Å²）。初始构象从前一窗口末帧延续，采用PM3/ff99SB组合力场。数据通过加权直方分析法（WHAM）整合，去除谐波势影响后计算平均力势（PMF）。与元动力学相比，伞形采样在QM/MM边界处调整氢连接原子位置（Cα-Cβ键），以提高计算精度。 Results 普通MD模拟 hBPGM单体具有a/b折叠结构，包含两个域，六个β链和十个α螺旋。进行了20纳秒的MD模拟以获取该复合物的稳定构象，用于进一步机制研究。能量及稳定性评估总能量结果显示，在MD模拟后，复合物达到了平衡状态。蛋白质和配体相对于晶体结构的均方根偏差（RMSD）值表明，在整个MD运行过程中，蛋白质骨架RMSD稳定在约1.3 Å；而配体2,3-BPG在初始100皮秒后的RMSD保持在大约1.0 Å，没有发生构象变化。均方根波动（RMSF）分析显示蛋白质中有两个片段（Glu127到Gln151和Glu224到Gln251）存在较大的构象变化，但这些区域都是远离活性位点的柔性环区。氢键网络：2,3-BPG带五个负电荷并拥有十个氧原子作为氢键供体，与多个hBPGM残基形成了一系列氢键，包括Arg10、His11等。磷酸基团：2,3-BPG中的两个磷酸基团被不同的口袋包围，分别由特定的精氨酸和其他催化残基稳定，形成了反应中心，对于合成酶和磷酸酶活性至关重要。综上所述，通过MD模拟证明了hBPGM/2,3-BPG复合物已达到平衡，为后续的量子力学/分子力学（QM/MM）机制计算做好了准备。磷酸酶活性（Phosphatase Activity）的结果 hBPGM的磷酸酶活性催化2,3-双磷酸甘油酸（2,3-BPG）水解为3-磷酸甘油酸（3-PGA），其反应机制分为两步，通过量子力学/分子力学（QM/MM）结合元动力学（metadynamics）和伞形采样（umbrella sampling）方法进行模拟，具体结果如下： 1. 磷酸酶反应的两步机制与能量势垒第一步：磷酸基团转移（2,3-BPG → His11）反应坐标： ξ1监测O3-P10键断裂（距离从1.7 Å增至4.0 Å）和P10-NE2键形成（距离从4.0 Å缩短至1.8 Å）。能量势垒元动力学：25.75 kcal/mol（TS1b，对应ξ₁=0.81 Å）。伞形采样：21.61 kcal/mol（TS1a，ξ₁=-0.59 Å）。构象变化 His11的咪唑环旋转60°，形成共价键（图3B）。 Mulliken电荷显示O3电荷从-0.688（反应物R）变为-0.852（中间态I），NE2电荷从-0.178变为-0.102，表明电子重排（表1）。第二步：质子转移（Glu89 → O3）反应坐标： ξ2 监测Glu89的HE2质子转移至O3（OE2-HE2距离从1.2 Å增至2.3 Å，HE2-O3距离从3.0 Å缩短至1.3 Å）。能量势垒元动力学：5.21 kcal/mol（TS2，ξ₂=-0.1 Å）。伞形采样：6.32 kcal/mol（ξ₂=-0.18 Å）。 Glu89的作用 Glu89羧基旋转90°，与O3形成氢键，稳定中间态（图6）。 O3电荷从-0.930（中间态I）变为-0.434（产物P），OE2电荷从-0.353变为-0.701（表2）。 2. 方法比较能量势垒差异：伞形采样因更精细的窗口划分（步长0.1 Å）和氢连接原子优化（Cα-Cβ键），其势垒（21.61 kcal/mol）较元动力学（25.75 kcal/mol）更接近实验推算值（20.63 kcal/mol）。过渡态构象验证：两种方法的过渡态构型中，P10-NE2距离分别为2.4 Å（元动力学）和2.5 Å（伞形采样），高度一致（图5）。结论磷酸酶活性的限速步骤为第一步的高能量势垒（约20 kcal/mol），而Glu89的质子转移显著加速第二步反应。QM/MM模拟结果与Wang等人的实验数据（S2机制）一致，揭示了hBPGM催化中残基协同作用的分子基础，为靶向酶活性调控提供了理论依据。 His11：作为亲核攻击位点，直接参与磷酸基团转移。 Glu89：通过质子转移降低第二步势垒，促进磷酸基团脱离。 Arg10/Arg62：通过氢键稳定磷酸基团，降低反应能量需求（图2E）。合酶活性（Synthase Activity）的结果合酶活性催化1,3-双磷酸甘油酸（1,3-BPG）转化为2,3-双磷酸甘油酸（2,3-BPG），包含三个步骤，其中后两步为磷酸酶反应的逆过程。研究通过QM/MM元动力学和伞形采样模拟，揭示了以下关键结果： 1. 反应路径与能量势垒第一步（磷酸基团转移）：反应坐标定义为P10（磷酸基团磷原子）与His11的NE2原子距离差（ξ₃ = R(P10-NE2) – R(P10-O6)）。元动力学模拟显示能量势垒为12.98 kcal/mol（TS1），伞形采样结果为9.47 kcal/mol（图4B）。过渡态（TS1）对应ξ₃ ≈ -0.69 Å，此时P10-NE2距离从4.7 Å缩短至3.4 Å（元动力学）或2.5 Å（伞形采样），P10-O6距离从1.8 Å延长至4.5 Å（表3）。限速步骤（第三步：3-PGA → 2,3-BPG）：元动力学计算势垒为19.36 kcal/mol，伞形采样势垒为15.24 kcal/mol，与实验推算值16.49 kcal/mol（基于速率常数kcat = 13.63 s⁻¹）高度吻合（图7A）。产物态（2,3-BPG）自由能显著低于反应物态（-6.40 kcal/mol），表明反应热力学有利。 2. 原子相互作用与电荷变化 His11的动态作用 His11位于柔性loop区域，在第一步中向1,3-BPG移动并旋转约30°，捕获磷酸基团（图8）。 Mulliken电荷分析显示，NE2原子电荷从-0.253（反应物R）变为-0.126（中间态I1），O6原子电荷从-0.296变为-0.779，表明磷酸基团转移伴随电子重排（表3）。 Arg10与Arg62的稳定作用：这两个精氨酸通过氢键稳定磷酸基团，降低反应势垒。突变实验证实，Cys23和Ser24的突变（如C23T、S24G）显著降低合酶活性，因其破坏底物与蛋白质的氢键网络（图8）。 3. 构象变化与二面角调整底物构象重排：反应过程中，1,3-BPG的O5和O6原子向Cys23和Ser24旋转，形成新的氢键（图8）。二面角O5-C11-C1-O3从-27.93°（R态）变为82.07°（I1态），表明羟基（O3）向Glu89方向旋转，为后续质子转移做准备（表3）。后面就是O3被拔掉质子，夺回磷酸了 4. 方法比较元动力学 vs. 伞形采样：伞形采样因更精确的氢连接原子处理（Cα-Cβ键）和窗口划分（步长0.1 Å），其势垒值（9.47 kcal/mol）较元动力学（12.98 kcal/mol）更接近实验数据。合酶活性优势：合酶总势垒（15.24 kcal/mol）显著低于磷酸酶（21.61 kcal/mol），与实验测得的速率常数差异（合酶13.63 s⁻¹ vs. 磷酸酶0.0125 s⁻¹）一致，解释了hBPGM以合酶活性为主导的生理功能。评论：妙就妙在磷酸酶势垒最高的一步是N从O上抢走P，众所周知PO一家亲，而这正好为合酶提供了自由能的降低。人家合酶是拆掉磷酸-羧酸酐，自然势垒不那么高，还不用质子转移。结论合酶活性通过His11的定向移动、Arg10/Arg62的静电稳定及底物构象调整，高效催化磷酸基团转移。QM/MM模拟不仅验证了Wang等人提出的S2机制，还量化了残基协同作用对降低能量势垒的贡献，为设计调控2,3-BPG水平的药物提供了原子级理论依据。活性位点的其他残基图9展示了在磷酸酶反应的TS1b状态(A)和P状态(B)，以及合成酶反应的TS1(C)和R状态(D)下活性区域内的关键相互作用。与反应相关的残基被标记出来，它们之间的氢键以黑色虚线表示。这些信息强调了这些关键残基在催化过程中的重要作用。能量障碍：通常情况下，断裂一个O-P键需要大约80.06 kcal/mol的能量。然而，在hBPGM反应中，由于催化残基及其他活性位点残基的贡献，这一能量障碍显著降低。正电荷氨基酸的作用：底物磷酸基团周围存在多个正电荷的氨基酸（如精氨酸），它们与磷酸基团的负电氧原子有强烈的相互作用，有助于稳定过渡态。具体作用： Arg10 和 Arg62：两个精氨酸残基通过氢键与释放的磷酸基团相互作用，在磷酸酶和合成酶活性过程中帮助稳定过渡态。 His188：在反应开始前，His188通过氢键与His11相互作用，帮助其在hBPGM中达到正确位置并参与底物与蛋白质的结合。His188还形成氢键与磷酸基团及His11的NE2原子相连，减少了反应路径长度（从NE2到P10），使磷酸基团朝向His11的方向移动。在磷酸基团从底物转移到His11之后，Arg10、Arg62和His188通过氢键与磷酸基团相互作用，有助于保持中间体结构的稳定性。重要性：这些残基对于磷酸酶活性和合成酶活性反应至关重要，它们不仅降低了反应的能量障碍，而且通过特定的相互作用稳定了过渡态和中间体，从而促进了反应的进行。论文总结本文通过对人类bisphosphoglycerate mutase (hBPGM)的量子力学/分子力学 (QM/MM)模拟研究，成功地揭示了该酶在磷酸化和脱磷酸化反应中的催化机制，并提供了关于其动力学特性的定量估计。研究人员使用了经典分子动力学(MD)结合QM/MM和metadynamics以及umbrella sampling方法，这些方法为研究生物大分子的动力学行为提供了一种准确而有效的方法。研究结果表明，hBPGM的主要活性是合成酶，而不是磷酸酶或异构酶，这与之前的研究结果一致。通过本研究，可以更好地理解hBPGM在调节红细胞中2,3-BPG水平方面的作用，这对于深入研究hBPGM在疾病治疗方面的应用具有重要意义。未来展望未来可以通过进一步的研究，探索hBPGM在不同生理条件下的功能差异，例如氧气浓度、pH值等，以更好地了解其在调节2,3-BPG水平方面的作用。可以尝试将其他计算方法（如蒙特卡罗模拟）与QM/MM相结合，以更全面地研究生物大分子的动态性质。可以探索hBPGM与其他相关酶之间的相互作用，以更好地理解它们在代谢途径中的协同作用。个人Comments 比较经典的画反应过程的工作，也没有任何额外的东西，可以借鉴其流程。确定一个好的构象，开跑就完了表明His确实可以亲核进攻磷酸酯，能垒也确实挺高的，20多kcal/mol，看来我得be cautious了由于是用伞形采样画PMF，得到的是free energy surface；簇模型应该只能得到potential energy surface，看来还是MD好反正都是距离作为CV，伞形采样就行了，不用metaD了。metaD可能就是可以同时算多个距离，但伞形采样也可以设多个group吧。只设置距离作为CV，也能把二面角（单键转动）同时模拟出来部分结构图画得有点丑。。。不能把蛋白残基和底物区分一下颜色嘛看来画FES就应该是直接用WHAM算出来的结果作图，没想象中这么麻烦文章内容总结主要由AI完成，如有错误恳请指出！
Molecular Dynamics · 2025-03-13

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